viernes, enero 05, 2007

El doble ciego, un caso personal

Muchas veces cuando a algún mago, curandero o adivino se le solicita un análisis de doble ciego reaccionan con indignación alegando que los escépticos siempre desconfían de la buena fé de las personas, que el que este libre de pecado tire la primera piedra, etc...
En realidad el doble ciego no se utiliza porque se considere un embustero charlatán a la persona que hace afirmaciones o experimentos sino porque la naturaleza humana asi lo requiere. A continuación voy a narrar mi propia experiencia con un experimento en el que me di cuenta hasta que punto es importante no conocer el nombre de tus muestras:

En el año 2000 realicé mi tésis de licenciatura en el Programa de Genetica Molecular de Plásmidos Bacterianos del CIFN, UNAM (hoy Programa de Ingenieria genómica del CCG, UNAM). Mi proyecto buscaba encontrar un fenómeno de evolución molecular en una familia de genes que se encontraba en el plásmido simbiótico de una bacteria llamada Rhizobium etli.
En teoría cuando un gen se duplica o triplica las tres copias tienden a acumular diferentes mutaciones y con el tiempo de ser iguales pueden llegar a ser completamente diferentes. Ese es el fenómeo que ocurre con la especiación y es la razón por la que el mismo gen en un perro y en un humano no se parecen a pesar de provenir del mismo gen. En cambio si se da esta duplicación en un mismo organismo en muchas ocasiones las copias pueden recombinar (recombinación en la wikipedia en inglés, prometo postear el capítulo de mi tésis que habla de esta para que la entiendan en español) en cuyo caso pueden compartir la información que cada una ha acumulado. De esta forma la mutación que trae una copia puede ser corregida usando la información de la segundao, o por el contrario, la mutación se homogeniza en las dos copias. El resultado de este proceso es que ambas copias se mantienen muy similares a lo largo de la evolución. Este fenómeno se denomina evolución concertada.
Para encontrar evolución concertada en la familia multigénica que estudiaba tuve que obtener la secuencia de las tres copias de la familia en 20 cepas de R. etli de diferentes orígenes geográficos. Esto es tuve que obtener la secuencia de 60 genes.
El proceso de aislamiento de cada gen se realizó de tal forma que podía asegurar que copia de que cepa estaba aislando y posteriormente mandé cada uno a secuenciar al Programa de Evolución Molecular del CCG, UNAM (para mas info sobre la secuenciación consulten mi artículo sobre genómica aquí).
Cuando uno recibe la secuencia de un gen recibe un archivo con imagenes como esta:

Figura 1

Se puede ver los picos de colores que indican la intensidad y resolución con que el laser del aparato leyó el fluoroforo de cada base y la letra de la base asignada según este. Esta es la parte central de la secuencia y la que tiene mayor calidad. Las partes laterales donde es muy baja la resolución de los picos se descartan. El problema viene en otras zonas con buena resolución donde uno se puede encotrar cosas como esta:

Figura 2

Eso que señala la flecha es un pico verde en medio de dos azules y debiera ser una adenina, A, pero el programa que analiza los picos lo descarta. Además si vemos el pico azul de la izquierda veremos que esta un poco grueso por lo que el programa lo define como dos citosinas, C, aunque podría ser solo una. En este caso la corrección se hace manualmente y basandose solo en el colmillo.
Cuando hice mis primeras correcciones (nada mas de prueba) me parecía muy sencillo y estaba yo emocionadísimo porque las copias de la cepa "1" se parecían mas entre si que a las copias de la cepa "2" , que a su vez erán idénticas entre si, lo que indicaba que si había evolución concertada. Estaba yo por salvar mis 6 análisis cuando por pura casualidad me dí cuenta de algo: Las 6 copias tenían un problema de resolución practicamente idéntico al de la figura 2, solo que para las copias de la cepa "1" siempre había quitado una C y añadido la A y para las copias de la cepa "2" había dejado las dos C´s descartado la A (osea que para una situación idéntica use dos criterios distintos de resolución) Entré en pánico!!! De alguna forma acababa de hacer trampa para favorecer la conclusión de evolución concertada y sin hacerlo de forma intencional!!!!(La secuencia entre las copias de las 20 cepas variaba solo en tres o cuatro bases por lo que un error así en una sola base podía alterar dramáticamente mis resultados!!! )
¿Cómo resolví mi dilema? Si leyeron mi post sobre secuanciación sabrán que siempre que se hace secuencia se debe hacer en multiples ocasiones de manera que yo tenía 3 secuencias independientes de cada copia de cada cepa. Lo que hice fue codificar dos veces los nombres de cada una de las secuencias de las copias de manera que sabia que había tres archivos con secuencia de una copia pero no sabia de que copia ni de que cepa. De esta forma pude depurar la secuencia ayudando a resolver las regiones problema con las tres repeticiones de secuencia que tenía de cada una (si en una repetición había un problema de resolución en una base probablemente en otra repetición la misma region no lo tiene y asi se resuelve) sin influirme por como quería que salieran mis resultados pues me era imposible relacionar la secuencia de las copias entre sí.
De cualquier forma el susto no se me pasó y comprobé la secuencia que yo depuré con la que otra estudiante había obtenido de un par de las cepas y que no buscaba los mismos datos que yo y como coincidieron supe que había realizado una corrección objetiva.


Esta es una pequeña muestra de porque la importancia del doble ciego: el cerebro y el entusiasmo pueden jugarnos bastante chueco y aunque no tengamos la intención de alterar nuestros resultados podemos hacerlo. Debemos tener la misma fuerza y valentía para cuestionar y arriegar nuestros resultados que la que generalmente tenemos para presumirlos, si no solo somos unos charlatanes pero con nosotros mismos.

Ahhh si la conclusión del trabajo es que si había evolucion concertada.

10 comentarios:

manolo_elmas dijo...

Reconozco que no he entendido un pimiento de toda la entrada, pero sí me he quedado con la clave: el doble ciego, ese que -efectivamente- suena a demonios a la mayoría de himbestigadores (sin ir más lejos, fué lo que originó la repetición del experimento con basófilos que dió al traste con la "memoria del agua" que preconizaba Benveniste, el gurú de la homeopatía).
Predicar con el ejemplo, y nunca mejor dicho.
Felicidades.

Javier Guzmán dijo...

Me relleva, mira que leí todo el post y pues, como que... Digamos que la bioquimica y asuntos de ese calibre no son mi especialidad, pero me da gusto conocer gente UNAM que sea y haga cosas tan especializadas como las tuyas.

Y bueno, lo que si me quedó claro fue eso del doble ciego, eso si!

Por cierto, jejeje, ¿quién es para ti el hombre de Ciencia que ha marcado con más fuerza a la humanidad? Hasta el momento mi gallo es Newton!! Cada día que me meto más en los Fluidos o en la transferencia de Calor veo que Sir Isaac es como un Mesías! (ja, luego dicen que soy fanático de Newton).

Saludox.

Juan Carlos Bujanda Benitez dijo...

Igual no entendí de que se trataba el experimento, pero si entendí como dice Manolo, que fue lo que le paso al Dr. Benveniste con los experimentos de Homeopatía.

Incluso creo que era sincero al creer que sus pruebas eran correctas, pero tanto el como su equipo estaban predispuestos a lo que buscaban.

Saludos

rovanpera dijo...

El problema de este tipo de enfoques es que luego la gente le puede poner muchos peros a tus experimentos.

Tú aislaste los 60 genes? Supongo que lo hiciste por PCR, usaste la misma polimerasa en todos los casos? Era de alta fidelidad? Luego, si son genes grandes la polimerasa pierde más resolución, además la tasa de mutación per se de la enzima siempre pone en riesgo la secuencia. Aunque hayas amplificado el gen de las 20 cepas en una misma reacción usando mezcla maestra de buffer, magnesio, etc., siempre queda la duda si la polimerasa no metió errores. Y no me parece trivial, porque los cambios que ves pueden ser errores generados por la polimerasa, pero que en realidad no están en la secuencia wildtype del bicho.


En fin.

Antonio dijo...

Interesante anécdota. Debo reconocer también que, sobre genética, conozco demasiado poco, a pesar de haber sido afectado personalmente por algunas mutaciones, pero me queda claro que la estrategia que utilizaste consistió en transformar el proceso para hacerlo a prueba de tu propia tendencia.

Algunas personas me han dicho que soy muy desconfiado. Normalmente agradezco el cumplido

Un abrazo

Kix dijo...

Chale, definitivamente como científica me hubiera muerto de hambre, pues no entendí un carajo... mejor me quedo como ingeniebria...

Definitivamente soy tu fan!

LabJournal dijo...

rovanpera:
Es cierto que hay ese riesgo pero creo que los ropios datos descartaron ese problema. Evisentemente use la taq platinum para limitar al mínimo la probabilidad de una mutación introducida por la polimerasa. En todo caso lo que hubieramos esperado de existir mutaciones debidas al PCR es una distribución aleatoria de las mismas en posición y base y evidentemente a una frecuencia baja. Cuando obtuve la secuencia solo encontré variación en las copias de 5 cepas(15 genes) y estos cambios estaban conservados en secuencia y posición y lo mas interesante es que todas estaban en tercera posición de los codones. Si las mutaciones hubieran sido introducidas por la polimerasa estas debieron distribuirse aleatoriamente en mi población de genes.
Gracias por el cmentario, siempre es bienvenida la discusión científica!!!!!!! lástima que ese proyecto ya quedó atras...

LabJournal dijo...

Javier:
A mi modo de ver la influencia se da por etapas. Desde mi punto de vista completamente sesgado a la biología watson y crick cambiaron la forma en que vemos al mundo y detonaron los grandes cambios que nos ha dado la genética. Sin dejar de reconocer que cualquiera de las aportaciones clásicas de la fisica y las mates tienen la importancia central de la ciencia fudamental

Manolo, Juan Carlos, ANtonio y Kix:
Perdon por pasarme de técnico, a lo mejor no debí clavarme tanto en la explicación de mi proyecto porque distrae de la idea central que es el sesgo involuntario de la interpretación de los datos pero me da guto que al final eso se entedió.
Cada quien entiende según su profesión, a mi las ingenierías, la economía y las ciencias sociales también se me atragantan!!!!!

Cesar De la luz dijo...

Lo que no entendí era lo del Doble Ciego...

lo demás...

menos :)

saludos

Anónimo dijo...

NI LO INTENTEN , LLEVO 24 AÑOS CONOCIENDOLO , Y TAMPOCO LE ENTIENDO, JAJAJA , PERO SE VE INTERESANTE.
SALUDOS YUCA
POR CIERTO SOY SU HERMANO