viernes, enero 05, 2007

El doble ciego, un caso personal

Muchas veces cuando a algún mago, curandero o adivino se le solicita un análisis de doble ciego reaccionan con indignación alegando que los escépticos siempre desconfían de la buena fé de las personas, que el que este libre de pecado tire la primera piedra, etc...
En realidad el doble ciego no se utiliza porque se considere un embustero charlatán a la persona que hace afirmaciones o experimentos sino porque la naturaleza humana asi lo requiere. A continuación voy a narrar mi propia experiencia con un experimento en el que me di cuenta hasta que punto es importante no conocer el nombre de tus muestras:

En el año 2000 realicé mi tésis de licenciatura en el Programa de Genetica Molecular de Plásmidos Bacterianos del CIFN, UNAM (hoy Programa de Ingenieria genómica del CCG, UNAM). Mi proyecto buscaba encontrar un fenómeno de evolución molecular en una familia de genes que se encontraba en el plásmido simbiótico de una bacteria llamada Rhizobium etli.
En teoría cuando un gen se duplica o triplica las tres copias tienden a acumular diferentes mutaciones y con el tiempo de ser iguales pueden llegar a ser completamente diferentes. Ese es el fenómeo que ocurre con la especiación y es la razón por la que el mismo gen en un perro y en un humano no se parecen a pesar de provenir del mismo gen. En cambio si se da esta duplicación en un mismo organismo en muchas ocasiones las copias pueden recombinar (recombinación en la wikipedia en inglés, prometo postear el capítulo de mi tésis que habla de esta para que la entiendan en español) en cuyo caso pueden compartir la información que cada una ha acumulado. De esta forma la mutación que trae una copia puede ser corregida usando la información de la segundao, o por el contrario, la mutación se homogeniza en las dos copias. El resultado de este proceso es que ambas copias se mantienen muy similares a lo largo de la evolución. Este fenómeno se denomina evolución concertada.
Para encontrar evolución concertada en la familia multigénica que estudiaba tuve que obtener la secuencia de las tres copias de la familia en 20 cepas de R. etli de diferentes orígenes geográficos. Esto es tuve que obtener la secuencia de 60 genes.
El proceso de aislamiento de cada gen se realizó de tal forma que podía asegurar que copia de que cepa estaba aislando y posteriormente mandé cada uno a secuenciar al Programa de Evolución Molecular del CCG, UNAM (para mas info sobre la secuenciación consulten mi artículo sobre genómica aquí).
Cuando uno recibe la secuencia de un gen recibe un archivo con imagenes como esta:

Figura 1

Se puede ver los picos de colores que indican la intensidad y resolución con que el laser del aparato leyó el fluoroforo de cada base y la letra de la base asignada según este. Esta es la parte central de la secuencia y la que tiene mayor calidad. Las partes laterales donde es muy baja la resolución de los picos se descartan. El problema viene en otras zonas con buena resolución donde uno se puede encotrar cosas como esta:

Figura 2

Eso que señala la flecha es un pico verde en medio de dos azules y debiera ser una adenina, A, pero el programa que analiza los picos lo descarta. Además si vemos el pico azul de la izquierda veremos que esta un poco grueso por lo que el programa lo define como dos citosinas, C, aunque podría ser solo una. En este caso la corrección se hace manualmente y basandose solo en el colmillo.
Cuando hice mis primeras correcciones (nada mas de prueba) me parecía muy sencillo y estaba yo emocionadísimo porque las copias de la cepa "1" se parecían mas entre si que a las copias de la cepa "2" , que a su vez erán idénticas entre si, lo que indicaba que si había evolución concertada. Estaba yo por salvar mis 6 análisis cuando por pura casualidad me dí cuenta de algo: Las 6 copias tenían un problema de resolución practicamente idéntico al de la figura 2, solo que para las copias de la cepa "1" siempre había quitado una C y añadido la A y para las copias de la cepa "2" había dejado las dos C´s descartado la A (osea que para una situación idéntica use dos criterios distintos de resolución) Entré en pánico!!! De alguna forma acababa de hacer trampa para favorecer la conclusión de evolución concertada y sin hacerlo de forma intencional!!!!(La secuencia entre las copias de las 20 cepas variaba solo en tres o cuatro bases por lo que un error así en una sola base podía alterar dramáticamente mis resultados!!! )
¿Cómo resolví mi dilema? Si leyeron mi post sobre secuanciación sabrán que siempre que se hace secuencia se debe hacer en multiples ocasiones de manera que yo tenía 3 secuencias independientes de cada copia de cada cepa. Lo que hice fue codificar dos veces los nombres de cada una de las secuencias de las copias de manera que sabia que había tres archivos con secuencia de una copia pero no sabia de que copia ni de que cepa. De esta forma pude depurar la secuencia ayudando a resolver las regiones problema con las tres repeticiones de secuencia que tenía de cada una (si en una repetición había un problema de resolución en una base probablemente en otra repetición la misma region no lo tiene y asi se resuelve) sin influirme por como quería que salieran mis resultados pues me era imposible relacionar la secuencia de las copias entre sí.
De cualquier forma el susto no se me pasó y comprobé la secuencia que yo depuré con la que otra estudiante había obtenido de un par de las cepas y que no buscaba los mismos datos que yo y como coincidieron supe que había realizado una corrección objetiva.


Esta es una pequeña muestra de porque la importancia del doble ciego: el cerebro y el entusiasmo pueden jugarnos bastante chueco y aunque no tengamos la intención de alterar nuestros resultados podemos hacerlo. Debemos tener la misma fuerza y valentía para cuestionar y arriegar nuestros resultados que la que generalmente tenemos para presumirlos, si no solo somos unos charlatanes pero con nosotros mismos.

Ahhh si la conclusión del trabajo es que si había evolucion concertada.
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